Recombinaison Génétique à l'Échelle de la Molécule Unique : Micromécanique des Jonctions de Holliday et Activité du Complexe RuvAB - Biophysique Access content directly
Theses Year : 2005

Genetic Recombination at the single molecule level : Holliday Junction Micromechanics and RuvAB complex Activity

Recombinaison Génétique à l'Échelle de la Molécule Unique : Micromécanique des Jonctions de Holliday et Activité du Complexe RuvAB

Abstract

This work is a study, at the single molecule level, of the recombination intermediate produced
when two homologous DNA molecules exchange their single-strands : the Holliday junction.
First, we show that a negative torque applied on a DNA molecule with an entirely palindromic
sequence leads to the formation of a Holliday junction. The strand exchange can then be directly driven
by mechanical torsion. Using this technique we accessed experimentally, and for the first time with such
a precision, to the value in solution of the helical pitch of DNA : 3.61 ± 0.03 nm/tr.
We also studied the kinetics of the strand exchange process under the influence of mechanical
constraints and in the presence of magnesium ions. We then developed a simple model of the mechanical
behavior of the Holliday junction under mechanical constraint in order to interpret the experimental data.
The single-strand exchange can also be catalyzed by specific enzymes. The mechanical work
produced during this activity defines these proteins as molecular motors. The second part of this work
concerns the study, at the single molecule level, of one of these enzymes : the RuvAB complex of the
bacteria Escherichia coli.
Firstly, we characterized the RuvAB migration activity on single Holliday junctions. In particular,
we found that the complex is highly processive and we estimated its speed at 37◦C and in presence
of 1 mM ATP : ∼ 43 base pairs exchanged per second.
Furthermore, we have shown that the RuvA subunit alone catalyzes the exchange of base-pairs
that occurs at the branch point of the structure.
Ce travail présente tout d'abord l'étude, à l'échelle de la molécule individuelle, de l'intermédiaire
de recombinaison formé par l'échange de simples brins entre deux molécules d'ADN homologues : la
jonction de Holliday.
Nous montrons tout d'abord qu'il est possible, à partir d'un ADN portant une séquence entièrement
palindromique, de former une jonction de Holliday en appliquant une torsion négative. Une fois
la jonction formée, la torsion permet également de contrôler de façon directe l'échange des simples brins.
Cette technique nous a permis d'accéder expérimentalement, avec une très bonne précision, à la valeur
en solution du pas hélicoïdal de l'ADN : 3.61 ± 0.03 nm/tr.
Ensuite nous avons étudié, en présence d'ions magnésium, la cinétique de migration de la jonction
de Holliday sous l'influence des contraintes mécaniques. Une modélisation simple du comportement
de la jonction de Holliday vis-à-vis des contraintes mécaniques a été développée permettant d'expliquer
leur influence sur le mécanisme de migration.
L'échange des simples brins peut également être catalysé par certaines enzymes. Le travail
mécanique développé au cours de cette activité catalytique fait de ces enzymes des moteurs moléculaires.
La seconde partie de ce travail porte sur l'étude en molécule unique d'un tel moteur : le complexe RuvAB
de la bactérie Escherichia coli.
Nous avons tout d'abord caractérisé la migration de jonctions de Holliday individuelles sous
l'action du complexe RuvAB. Nous avons notamment montré la très grande processivité du complexe et
nous avons pu estimer la vitesse de migration à 37◦C et en présence d'1 mM d'ATP : ∼ 43 paires de
bases échangées par seconde.
D'autre part, et pour finir, nous avons mis en évidence le rôle catalytique de la sous-unité RuvA
dans l'échange des paires de bases au niveau du point de branchement.
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Holliday_Dawid_2006.pdf (8.01 Mo) Télécharger le fichier

Dates and versions

tel-00012063 , version 1 (30-03-2006)

Identifiers

  • HAL Id : tel-00012063 , version 1

Cite

Alexandre Dawid. Recombinaison Génétique à l'Échelle de la Molécule Unique : Micromécanique des Jonctions de Holliday et Activité du Complexe RuvAB. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2005. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00012063⟩
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